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國內外基因zhiliao產品開展的非臨床研究、長期隨訪獲得的臨床經驗以及基因組整合位點分析方法的明顯改進，都有助于更好地理解整合性基因zhiliao載體相關風險。通常認為，很多能夠介導外源基因轉入細胞核的載體（如逆轉錄病毒載體、轉座子元件和基因編輯產品等）有基因組整合潛力，需要通過長期隨訪觀察遲發性不良反應的風險；根據目前的認識和研究數據，質粒、痘病毒、腺病毒和腺相關病毒（AAV）等載體的基因zhiliao產品整合風險較低，國際上開展的臨床試驗中也表現出較低的遲發性不良反應風險。當載體或基因zhiliao產品原有的風險特征增加時，例如經過修飾以攜帶基因組編輯成分的質?；蚋淖兘oyaofang式以...

基因編輯產品除了適用基因zhiliao產品的一般考慮以及整合性載體的特殊考慮外，長期隨訪中還應額外關注脫靶風險，量化評估脫靶活性和在靶活性之間的相關性，或利用在靶活性來預測脫靶活性的水平。在開發過程中應同時關注基因轉導效率、脫靶效率、插入突變情況、目的基因在靶細胞中整合位點及表達。評估基因zhiliao產品整合進基因組的可能性，判斷是否需要開展另外的遺傳毒性研究，評估插入突變（插入位點、插入拷貝數等）引起的遺傳毒性風險。需要關注脫靶編輯、轉座子轉座印跡引起的遺傳毒性問題；鑒定/表征基因組整合位點。非臨床研究是藥物開發的重要環節之一。隨著脫靶影響因素、降低策略及脫靶檢測技術研究的不斷深入，未來C...

細胞經基因修飾后會改變其生物學特性，同時也會帶來新的安全性風險，如基因編輯脫靶風險、載體插入突變風險、載體重組風險、表達的轉基因產物的風險等。細胞經基因修飾后會改變其生物學特性，同時也會帶來新的安全性風險，如基因編輯脫靶風險、載體插入突變風險、載體重組風險、表達的轉基因產物的風險等?；诨蛐揎椉毎漠a品種類繁多、各有特點，除上述一般技術要求外，還應基于產品的性進行相應的特殊考慮。本指導原則列舉了以下三種情形的特殊考慮?；蚓庉嬛委熯^程中安全性評價，即脫靶效應的檢測。武漢種子脫靶檢測政策基因zhiliao產品特有的可能會引起遲發性不良反應的風險因素包括：基因組整合活性基因zhiliao產品可能...

長期隨訪的觀察時間長期隨訪的持續時間應確保足以觀察到受試者因產品特性、暴露情況（生物分布和給藥途徑）等導致的風險，應不短于遲發性不良反應的預期發生時間。一般而言，針對不同類型的基因zhiliao產品建議如下：?具有基因組整合活性的載體（例如γ-逆轉錄病毒和慢病毒載體）和轉座子元件建議觀察不短于15年。?可以產生持續ganran、或有潛伏再jihuo風險的細菌或病毒載體（如單純皰疹病毒）建議觀察15年或至數據表明不再存在任何風險（ganran或再jihuo）?；蚓庉嫯a品建議觀察15年或至數據表明不再存在任何風險。?腺相關病毒載體建議觀察5年或至數據表明不再存在任何風險。crispr脫靶檢測，推...

插入突變風險評估一些整合性載體（如逆轉錄病毒、慢病毒、轉座子）可將外源基因插入整合到細胞基因組中，這可能會導致關鍵基因突變或jihuo原基因，從而導致惡性liu風險增加。影響插入突變的關鍵風險因素包括：（1）載體的整合特征，如插入位點的偏好性；（2）載體的設計，如增強子、啟動子等構建元件的活性，影響鄰近基因的潛力；產生剪接突變體的潛在剪接位點或多聚腺苷酸信號等；（3）細胞載體拷貝數；4）轉基因表達產物的功能活性（如與細胞生長調控相關）和表達水平；5）靶細胞群的轉化可能性，這可能與細胞的分化狀態、增殖潛力、體外培養條件和體內植入環境等有關。脫靶檢測實驗室，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高，檢測...

對基于慢病毒/逆轉錄病毒載體的基因zhiliao產品，如出現與可復制xingbing毒可能相關的不良事件，還應開展可復制xingbing毒（replicablecompetentlentivirus/retrovirus，RCL/RCR）的檢測。關于基因編輯產品的特殊考慮基因編輯產品除了適用基因zhiliao產品的一般考慮以及整合性載體的特殊考慮外，長期隨訪中還應額外關注脫靶風險，量化評估脫靶活性和在靶活性之間的相關性，或利用在靶活性來預測脫靶活性的水平。如果基因zhiliao產品通過全身給yaofang式遞送，長期隨訪中的安全性監測不僅包括靶qiguan或靶組織的脫靶活性，而且還應包括可能發...

gRNA的長度和錯配： 17個核苷酸長度的gRNA顯示出更高的基因組編輯效率。相比之下，18-20 bp的長度顯示出較低的基因組編輯效率。在人類細胞中減少潛在脫靶效應的指導方針：1) 應避免在PAM的7-10 bp范圍內靶序列有超過3個錯配；2) 在PAM的12 bp內，應避免sgRNA 凸起以減少脫靶效應。gRNA的化學修飾：在gRNA核糖磷酸骨架中加入2?-O-甲基-3?-膦?；宜狨е挛稽c特異性修飾，使脫靶切割減少40-120倍，同時保持靶向性能。gRNA上游5'發夾結構的修飾可以提高Cas9和Cas12的特異性，降低脫靶效應。基因編輯技術脫靶檢測，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高...

圍繞大家關心的CRISPR基因編輯安全性問題，我們首先對CRISPR脫靶位點檢測技術進行一次大盤點，在sgRNA設計階段需要如何做才能夠盡可能地避免脫靶現象的發生。較簡單的脫靶位點檢測方法是全基因組測序（WGS），但在實際使用中，即使測序深度達到100X，也很難發現一些低頻率的脫靶位點，同時測序成本卻非常高。為彌補WGS的這些缺陷，常見的脫靶位點檢測技術都需要對脫靶位點進行捕獲富集，來提高檢測靈敏度，降低測序成本。按照實驗原理的不同，脫靶位點檢測技術可以分為細胞外、細胞內和其他特殊方法這3類。脫靶檢測CRO，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高，檢測效率高，結果準確率高。杭州種子基因脫靶檢測gu...

細胞外檢測方法：細胞外檢測方法較為直接，將基因組提純后進行CRISPR體外切割實驗，再捕獲發生脫靶切割的位點即可。1) Digenome-seqDigenome-seq是較早提出的一類細胞外脫靶位點檢測方法，提純的基因組DNA被Cas9/sgRNA切割后，再經過標準的全基因組測序流程獲得測序數據，之后需要較為復雜的生物信息學分析才能夠獲得CRISPR切割位點的信息。總體來講，這種方法測序成本較高，并且檢測靈敏度也有限。2)SITE-seq為了有效檢測到低頻脫靶位點，一般需要在建庫時定向捕獲CRISPR切割位點。SITE-seq就是這樣一種測序方法，提純的基因組DNA經過Cas9/sgRNA切割...

TCR修飾免疫細胞的脫靶毒性可通過評估TCR與人體自身抗原肽的交叉識別能力來評估。首先，應采用體外試驗測定TCR修飾的免疫細胞與人自身抗原肽-HLA（與遞呈靶抗原肽的HLA等位基因相同）復合物的親和力，并說明抗原肽的選擇依據及選擇范圍。此外，還應研究其他相關或不相關的蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR與人自身抗原肽有交叉反應可能，應確定靶抗原肽的較小識別基序（motif），并采用計算機預測分析評估交叉反應性。如果計算機預測可識別出具有潛在交叉反應性的抗原肽，應在體外測定TCR修飾免疫細胞對表達相應蛋白或遞呈相應抗原肽的的細胞的識別能力。如果不能排除交叉反應性，應基于含有潛在交叉反應性抗原肽...

基因編輯產品除了適用基因zhiliao產品的一般考慮以及整合性載體的特殊考慮外，長期隨訪中還應額外關注脫靶風險，量化評估脫靶活性和在靶活性之間的相關性，或利用在靶活性來預測脫靶活性的水平。在開發過程中應同時關注基因轉導效率、脫靶效率、插入突變情況、目的基因在靶細胞中整合位點及表達。評估基因zhiliao產品整合進基因組的可能性，判斷是否需要開展另外的遺傳毒性研究，評估插入突變（插入位點、插入拷貝數等）引起的遺傳毒性風險。需要關注脫靶編輯、轉座子轉座印跡引起的遺傳毒性問題；鑒定/表征基因組整合位點。非臨床研究是藥物開發的重要環節之一。高精度脫靶檢測，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高，檢測效率高...

如果基因zhiliao產品通過全身給xingfang式遞送，長期隨訪中的安全性監測不僅包括靶qiguan或靶組織的脫靶活性，而且還應包括可能發生在其他組織和qiguan中的脫靶活性。基因組整合性或者脫靶活性的分析通常需采用有創性12檢測方法取得樣本，實施時還需要考慮技術和倫理上的可行性，例如靶向視網膜或肝臟等組織的基因zhiliao產品，可能難以對靶細胞采樣，這種情況下可能需要通過密切的臨床隨訪等方式間接評估風險；同時，選擇易于采樣的替代細胞也可能提供關于相關信息，例如靶向骨髓造血干細胞的基因zhiliao產品，可以通過采集外周血細胞或富集外周血干細胞進行觀察。如何檢測是否發生脫靶？廣州基因療...

由于設計的sgRNA會與非靶點DNA序列錯配，引入非預期的基因突變，即脫靶效應(Off-targeteffects)。脫靶效應造成了研究中的許多不確定性，這無疑限制了該技術的應用。因此，研究者希望能開發有效的方法來檢測脫靶效應。在目前主流的脫靶效應評估方法中，有一種方法為GUIDE-seq，其原理是利用一種短的雙鏈寡聚核苷酸（dsODN）標記CRISPR/Cas誘導的脫靶斷裂，然后對標簽所在的基因組區域進行高通量測序，通過生物信息學分析從而確定脫靶位點。利用該技術可以在基因組范圍內檢測CRISPR脫靶效應，從而改變了以往先預測假定脫靶位點再檢測的思路；與其他的評估方法相比，GUIDE-seq更...

自基因zhiliao出現之日起，安全性問題就隨之產生了，并成為阻礙基因zhiliao研發的一大障礙，吳寧博士認為：“基因zhiliao產品的研發和上市，安全性會將是一個非常重要考量。如果一款產品它安全性有問題的話，在市場化道路上就會受到很大影響。尤其是基因zhiliao，目前處于起始階段，一旦出現不良事件，很有可能對整個行業都會產生致命打擊。具體說來，基因zhiliao的安全性問題主要涉及基因插入突變、脫靶、生物分布和持久性、潛伏再jihuo以及潛在免疫原性等。”脫靶檢測技術是一系列針對CRISPR/Cas9系統作用機制研發的用于確定CRISPR/Cas9系統基因編輯準確性檢測工具。連云港種子...

gRNA的長度和錯配： 17個核苷酸長度的gRNA顯示出更高的基因組編輯效率。相比之下，18-20 bp的長度顯示出較低的基因組編輯效率。在人類細胞中減少潛在脫靶效應的指導方針：1) 應避免在PAM的7-10 bp范圍內靶序列有超過3個錯配；2) 在PAM的12 bp內，應避免sgRNA 凸起以減少脫靶效應。gRNA的化學修飾：在gRNA核糖磷酸骨架中加入2?-O-甲基-3?-膦?；宜狨е挛稽c特異性修飾，使脫靶切割減少40-120倍，同時保持靶向性能。gRNA上游5'發夾結構的修飾可以提高Cas9和Cas12的特異性，降低脫靶效應。如何降低脫靶效應？選擇特異的gRNA； 使用RNP； 使...

如何檢測脫靶效應？在gRNA修飾中，截短的sgRNA是一種減少脫靶效應的簡單方法，并且基于RNP的遞送在大多數情況下適用于獲得更高的目標活性。此外，選擇合適的Cas變體對于減少脫靶效應也至關重要。但選擇合適的脫靶檢測工具，也是重中之重。脫靶預測結合PCR檢測法，利用脫靶預測軟件預測潛在的脫靶位點，PCR擴增預測的脫靶位點，利用直接測序或酶切法檢測脫靶情況。操作簡便、成本低偏倚性預測。全基因組測序，一種通過高通量測序檢測脫靶突變的方法，需要選擇適當的參考基因組過濾背景突變，數據比對分析獲得含有PAM基序的潛在修飾位點，進一步基因擴增驗證其突變情況。高通量全基因組范圍檢測可檢測SNPs，Indel...

Cas9蛋白是一種切割外來DNA的酶，像一把分子剪刀。該蛋白通常與兩個RNA分子結合：crRNA和另一個稱為tracrRNA（或“反式jihuocrRNA”）。這兩個RNA分子引導Cas9到它將進行切割的目標部位。這段DNA是與crRNA的20個核苷酸互補的。CRISPR技術是從細菌和古細菌的自然防御機制中改編而來的。這些生物體使用CRISPR衍生的RNA和各種Cas蛋白，包括Cas9，來阻止病毒和其他異物的攻擊。它們主要通過切碎和破壞外來入侵者的DNA來做到這一點。當這些組件被轉移到其他更復雜的生物體中時，它允許對基因進行操縱，或“編輯”。脫靶切割位點已在基因編輯技術,CRISPR / Ca...

不同基因zhiliao產品的特殊考慮。關于整合性載體的特殊考慮如受試者接受整合性載體基因zhiliao產品，例如轉座子元件、γ-逆轉錄病毒、慢病毒及其他逆轉錄病毒載體，或利用整合性載體或基于轉座子的載體在體外修飾的細胞，長期隨訪中需格外關注基因zhiliao產品的基因組整合風險，建議申辦方分析基因zhiliao載體在靶細胞或相關替代細胞的基因組中整合的影響（例如是否存在克隆性生長、是否存在優勢克隆、克隆性生長是否導致惡性liu等）。如果基因組整合相關風險的分析可行，應注意以下幾點：?在接受基因zhiliao產品的較初5年內，兩次檢測間的采樣間隔建議不超過6個月。此后每年至少檢測一次，直至檢測數...

基因編輯定量脫靶檢測:基因編輯定量脫靶檢測,使用CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs等設計核酸酶進行基因組編輯，可以將遺傳物質定向導入哺乳動物基因組的特定位點。然而，可能會出現非預期的靶上和靶外基因組修飾，這可能導致基因組不穩定，并破壞正?；虻墓δ?，從而可能導致臨床前和臨床研究中的安全問題。.基于PCR的檢測唯可生物采用LTA-PCR方法分析基因組編輯引起的靶向和非靶向整合。1.方便地檢測脫靶目標變化和隨機性2.適用于解決監管機構提出的具體問題3.定制化生物信息學分析基于NGS的檢測唯可生物使用靶向富集測序(TES)進行全基因組檢測和定量靶向和非靶向改變。我們可在一次反應中經濟高效...

不同基因zhiliao產品的特殊考慮。關于整合性載體的特殊考慮如受試者接受整合性載體基因zhiliao產品，例如轉座子元件、γ-逆轉錄病毒、慢病毒及其他逆轉錄病毒載體，或利用整合性載體或基于轉座子的載體在體外修飾的細胞，長期隨訪中需格外關注基因zhiliao產品的基因組整合風險，建議申辦方分析基因zhiliao載體在靶細胞或相關替代細胞的基因組中整合的影響（例如是否存在克隆性生長、是否存在優勢克隆、克隆性生長是否導致惡性liu等）。如果基因組整合相關風險的分析可行，應注意以下幾點：?在接受基因zhiliao產品的較初5年內，兩次檢測間的采樣間隔建議不超過6個月。此后每年至少檢測一次，直至檢測數...

改進Cas變體使用SpCas9和SaCas9 變體：已研發出諸如SpCas9-Nickase、dCas9 、dCas9–FokI、xCas9、Cas9-NG、evoCas9、SpCas9 – HFI、eSpCas9和Hypa-Cas9等多種Cas變體，可降低脫靶效應。改進的Cas9同源物具有更廣的PAM功能和特異性：實驗表明Cpf1、CRISPR-Cpf1-RNP可降低脫靶效應。CRISPR 遞送方法：基于病毒的遞送方法：腺病毒 (AdV) 顯示出整合到靶細胞基因組中的微弱潛力，這一特征有利于限制脫靶效應。然而，AdVs 會引發免疫反應，目前還不能完全排除它與宿主基因組整合的可能性。非病毒遞送...

如何檢測脫靶效應？在gRNA修飾中，截短的sgRNA是一種減少脫靶效應的簡單方法，并且基于RNP的遞送在大多數情況下適用于獲得更高的目標活性。此外，選擇合適的Cas變體對于減少脫靶效應也至關重要。但選擇合適的脫靶檢測工具，也是重中之重。脫靶預測結合PCR檢測法，利用脫靶預測軟件預測潛在的脫靶位點，PCR擴增預測的脫靶位點，利用直接測序或酶切法檢測脫靶情況。操作簡便、成本低偏倚性預測。全基因組測序，一種通過高通量測序檢測脫靶突變的方法，需要選擇適當的參考基因組過濾背景突變，數據比對分析獲得含有PAM基序的潛在修飾位點，進一步基因擴增驗證其突變情況。高通量全基因組范圍檢測可檢測SNPs，Indel...

使用CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs等設計核酸酶進行基因組編輯，可以將遺傳物質定向導入哺乳動物基因組的特定位點。然而，可能會出現非預期的靶上和靶外基因組修飾，這可能導致基因組不穩定，并破壞正?；虻墓δ埽瑥亩赡軐е屡R床前和臨床研究中的安全問題?；蚓庉嬆壳暗拿摪蟹治黾夹g主要依賴于生物信息學預測和全基因組脫靶檢測技術。這些預測缺乏可靠性，因為它們只涵蓋了潛在基因組改變的一小部分。而頻率低于0.5%的脫靶突變大多無法被全基因組脫靶檢測技術檢測到。我們是開發用于全基因組靶向/非靶向分析的無偏分析的先驅。靶向基因組編輯唯可生物為基因編輯安全性評估提供多方面的PCR和基于NGS的分析。我...

不論在科研還是臨床中，CRISPR技術的使用都帶來了非常高的回報，也同時伴隨著各種風險，這其中脫靶現象就研究者們較為擔心的一類風險。本文中我們盤點了多種主流的CRISPR脫靶位點檢測方法，但沒有一種方法是適用于所有CRISPR技術的脫靶檢測，一個項目中只使用一種脫靶檢測方法也是不足夠的。如何在實驗中，特別是臨床試驗中多方面評估CRISPR的脫靶風險，需要將多種脫靶檢測方法有效組合。同時，每一條sgRNA都不可避免地存在脫靶位點，如何評估這種風險，如何降低這種風險，具體的解決方案我們用臨床實例來為大家介紹。脫靶檢測政策，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高，檢測效率高，結果準確率高。上海育種脫靶檢...

基因zhiliao產品特有的可能會引起遲發性不良反應的風險因素包括：基因組整合活性基因zhiliao產品可能會采用修飾宿主基因組的技術，并有可能在宿主細胞或組織中持續存在。很多基因zhiliao載體的基因整合不會指向基因組的特定位點，可能在整合位點處產生插入突變、或jihuo整合位點附近的原基因等，進而破壞重要基因功能或增加惡性liu的風險，例如，國外已有多項研究報告在接受了使用γ-逆轉錄病毒載體轉導的基因修飾細胞zhiliao的受試者中發生白血病。因此，對于存在此類風險的產品，有必要進行長期隨訪臨床研究以評估出現遲發不良反應的風險。脫靶檢測方法，推薦唯可生物，實驗實力強，專業性高，檢測效率高...

誘導多能干細胞來源的細胞產品。誘導多能干細胞（inducedpluripotentstemcell，iPS）自身具有致瘤性風險，在體內可形成畸胎瘤，整合病毒載體的使用和誘導多能性可能增加iPS細胞插入致突變性和致性的風險。因此，應在shou次臨床試驗前完成致瘤性試驗。若設計科學合理，能夠滿足評價要求，也可在持續時間足夠長的毒性研究中評估致瘤性風險。體內致瘤性試驗建議采用摻入未分化iPS細胞的細胞產品作為陽性對照，以確認實驗系統的靈敏度。如果iPS細胞設計了機制以降低致瘤風險，應在體內試驗中確認/驗證此類機制的功能 高深度全基因組重測序服務,該方法能多方位精細地對基因編輯的細胞或個體進行of...

CRISPR/Cas系統是細菌和古細菌在不斷進化的過程中產生的適應性免疫防御機制，它應用CRISPR RNA（crRNA）以堿基互補的形式引導相應的Cas蛋白識別入侵的外源基因組，并對其DNA進行剪切，用以保護自身的基因組免受外源核酸如噬菌體、病毒等的干擾和破壞。經過人為改造后，可在真核細胞中實現高度靈活且特異的基因組編輯，通過設計特異性向導RNA(Single guide RNA, sgRNA)序列與靶序列進行堿基配對，從而引導Cas蛋白結合到靶序列處，行使DNA切割功能，然后利用細胞的非同源性末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源重組(Homol...

目前鼓潤已掌握了該項技術，簡述如下：1、CRISPR與dsODNtag整合的實驗技術及高通量測序建庫流程將靶向于目標基因組位點的CRISPR質粒與dsODNtag以核電轉的方式同時轉染入真核細胞，CRISPR造成基因組雙鏈斷裂后，dsODNtag將整合入斷點處，作為后續分析在靶與脫靶情況的標記。轉染后3天收集細胞的DNA進行高通量建庫。2、GUIDE-seq生信分析方法1）搭建了高通量測序的數據分析流程。2）利用該技術分析了CRISPR靶向編輯某細胞系基因的在靶與脫靶情況。其中一例樣品的分析結果如圖4所示：Sequencesofoff-targetsitesidentifiedbyGUIDE-...

BLESS：利用生物素標簽對DSBs進行原位標記，后經PCR擴增實現對于生物素標記片段的富集，并通過二代測序實現脫靶位點檢測。直接檢測細胞中的切割位點，靈敏度與細胞、組織密切相關。LAM-HTGTS，片段化的gDNA經過LAM-PCR引入接頭，然后進行全基因組易位測序。高通量的全基因組范圍檢測，可準確檢測DSBs引發的重排。GUIDE-Seq，將dsODN s標簽整合到DSBs位點，通過二代測序檢測這些標簽所在的基因組區域，從而確定脫靶突變的位置。廣使用的細胞內檢測方法。能檢測低頻脫靶突變。Digenome-Seq，片段化的gDNA與CRISPR/RNP混合孵育，進行全基因組測序檢測脫靶...

不論在科研還是臨床中，CRISPR技術的使用都帶來了非常高的回報，也同時伴隨著各種風險，這其中脫靶現象就研究者們較為擔心的一類風險。本文中我們盤點了多種主流的CRISPR脫靶位點檢測方法，但沒有一種方法是適用于所有CRISPR技術的脫靶檢測，一個項目中只使用一種脫靶檢測方法也是不足夠的。如何在實驗中，特別是臨床試驗中多方面評估CRISPR的脫靶風險，需要將多種脫靶檢測方法有效組合。同時，每一條sgRNA都不可避免地存在脫靶位點，如何評估這種風險，如何降低這種風險，具體的解決方案我們用臨床實例來為大家介紹。選擇潛在的脫靶位點，例如選擇gRNA預測網站上Top 5潛在脫靶位點，進行Sanger測序...