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中國藥科大學姜虎林教授團隊采用Umibio外泌體專用裂解液
循環腫瘤細胞(CTCs)和腫瘤源性外泌體(TDEs)在轉移級聯中發揮著不可替代的作用，阻止它們通過血液循環到達遠處器官有助于降低癌癥復發和轉移的可能性。然而，能夠同時阻止ctc和tde到達遠端器官的技術到目前為止還沒有得到徹底的發展。在這里，受血液灌流的啟發，開發了一種促轉移衍生物消除劑(PMDE)，用于從外周血中去除ctc和tde，同時抑制它們在遠處器官的生物分布。該裝置設計了一種雙抗體修飾的免疫吸附劑，填充在捕獲柱中，將外周血從體內抽出，流經該柱特異性地捕獲ctc和tde，然后將純化后的血液重新輸入體內。PMDE能有效去除外周血中的ctc和tde，具有良好的生物相容性。有趣的是，PMDE裝置可以通過清除ctc和tde來抑制他們在肺和肝臟中的生物分布。這項工作為抗轉移治療提供了新的視角，在預防轉移和復發的臨床應用中具有廣闊的前景。
圖1 A) tde、ctc和轉移之間的三角關系示意圖。B)說明促轉移衍生物清除器機制。
首先作者使用熒光基團標記的抗體進行偶聯，通過倒置熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡進行成像表征，發現抗體可以成功偶聯至微球表面；使用熒光基團標記的抗體，建立了抗體濃度和熒光強度之間的標準曲線，考察 anti-EpCAM、anti-EGFR 抗體的偶聯密度和偶聯效率，得到較高的抗體偶聯密度，每毫克抗體功能化的微球，具有 1011 個以上的結合位點；通過免疫熒光實驗，考察了抗體在堿性條件下的抗原識別活性，發現抗體經碳酸鹽偶聯液處理后依然保持原有的抗原識別活性；考察抗體功能化 SM 在 4 °C，避光條件下可儲存 60 天以上，具備良好的儲存穩定性；
圖2 腫瘤特異性抗體功能化的瓊脂糖微球的表征與驗證
緊接著，作者在靜態條件下驗證了SM-EE 對 CTCs 和 TDEs 的捕獲能力；確證了模型 CTCs 和 TDEs 的標志物 EpCAM、EGFR 的表達，
MDA-MB-468 作為模型 CTCs，它的外泌體作為模型 TDEs；
HeLa 及其外泌體作為陰性對照；使用激光共聚焦成像對抗體功能化的 SM 捕獲 CTCs 和 TDEs 進行可視化表征，發現CTCs 和 TDEs 可以被成功捕獲；DAPI 染色的細胞或者 DiR 染色的外泌體在濃度-熒光強度方面呈現良好的線性關系，以此建立了捕獲效率的計算方法； 考察了四種不同 SM 的捕獲效率，發現 SM-EE 的捕獲效率最高，證明多價抗體使用的必要性，SM-EE 被選擇用于后續實驗；考察 SM-EE 投入的量、捕獲時間、SM-EE 儲存時間對捕獲效率的影響。發現微球投入越多，捕獲效率越高；捕獲時間在 60 min 基本達峰值；微球儲存 60 天依然保持原有的捕獲效率，證明微球具有良好的儲存穩定性。
圖3 在靜態條件下捕獲癌細胞和tde
然后，作者闡述了在閉環循環系統模擬實驗中，影響捕獲效率的因素。在閉環循環系統模擬實驗中，考察了捕獲柱填料量、循環時間、循環流速、循環介質、CTCs 與 TDEs 相互作用對捕獲效率的影響，同時也考察了PMDE 的捕獲專一性，為后續動物在體循環實驗提供了參數設置的參考。結果表明，以 SM-EE 為免疫吸附劑的 PMDE，對 CTCs 和 TDEs 有較好的捕獲效率，CTCs 和 TDEs 的捕獲效率分別可達 53.5 ± 5.9 %和42.0 ± 3.0 %。
圖4 閉環循環系統中使用PMDE去除ctc和tde
在隨后的研究中，作者考察了從 PMDE 中釋放 CTCs 和 TDEs 作為腫瘤樣本的可行性。首先，考察了CTCs 和 TDEs 從 SM-EE 中的釋放效率，發現釋放效率分別可達92.7 ± 1.2 % 和 85.6 ± 1.3 %；其次，考察了經 SM-EE 釋放的外泌體相比于超速離心法獲得的外泌體的純度，其相對純度為 85.9 ± 3.2 %；并考察了釋放后外泌體的形態結構和大小，發現釋放的外泌體依然保持完整的囊泡的結構，不受捕獲和釋放過程的影響；最后，考察了 CTCs 經 SM-EE 釋放后的活性以及增殖能力，發現 CTCs 被釋放后，保持良好的細胞活性和較強的細胞增殖能力，幾乎不受捕獲和釋放過程的影響。
圖5 釋放捕獲的CTCs和tde
接下來，作者考察了PMDE 血液相容性和生物相容性。以已上市的血液灌流材料 Biosky 吸附劑為對照，從紅細胞相容性、血漿蛋白吸附、血小板激活、凝血性質、血常規、細胞相容性等方面考察SM-EE 的生物安全性，證明了 SM-EE 具有良好的血液相容性和生物相容性。
圖5 釋放捕獲的CTCs和tde
接下來，作者考察了PMDE 血液相容性和生物相容性。以已上市的血液灌流材料 Biosky 吸附劑為對照，從紅細胞相容性、血漿蛋白吸附、血小板激活、凝血性質、血常規、細胞相容性等方面考察SM-EE 的生物安全性，證明了 SM-EE 具有良好的血液相容性和生物相容性。
圖7 在大鼠模型中的雙重清除CTCs和TDEs及PMDE的體內生物安全性評價
為了進一步研究 PMDE 抗轉移治療的潛力，作者進行了概念驗證實驗。為減少實驗偏差，以 SM-BSA 為陰性對照，以未處理組為空白對照。如圖 7 描述了尾靜脈注射后 3 h 獲得的小鼠體內熒光圖像。無論實驗對象是 CTCs、TDEs 還是兩者，SM-EE 組的熒光信號均顯著最低，表明 CTCs 和 TDEs 向各臟器分布最少。
圖8 PMDE抑制ctc和tde向遠處器官的生物分布
綜上所述，本研究提供了一種很有前景的方法，可以同時減少CTCs和TDEs通過血流分布到遠處器官，在預防腫瘤轉移和復發方面具有廣闊的臨床應用前景。該研究以“A Pro-Metastatic Derivatives Eliminator for In VivoDual-Removal of Circulating Tumor Cells and Tumor-Derived Exosomes Impedes their Biodistribution into Distant Organs”為題發表在國際高水平學術期刊Advanced Science雜志上，中國藥科大學為第一作者及第一通訊作者單位，第一作者為中國藥科大學研究生孫應，通訊作者為中國藥科大學藥學院姜虎林教授。該研究裂解外泌體所用的外泌體專用裂解液由上海宇玫博生物科技有限公司（Shanghai Umibio Co., Ltd.）提供。
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