相較于原核表達(dá)體系，真核體外蛋白表達(dá)的he xin優(yōu)勢(shì)在于具備部分翻譯后修飾能力，但 關(guān)鍵修飾途徑仍存在明顯局限。在缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的情況下，糖基化修飾通常終止于高甘露糖型（Man?GlcNAc?）階段，無(wú)法合成復(fù)雜雙觸角唾液酸化糖鏈。這一缺陷直接影響zhi liao性抗體的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性（ADCC）效應(yīng)。同時(shí)，裂解物中二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）與分子伴侶（如BiP）的活性不足，導(dǎo)致含多對(duì)二硫鍵的蛋白錯(cuò)誤折疊率升高40%-60%。為克服此瓶頸，需在裂解物中外源性添加重組糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體（如GnT-I/GnT-II/FUT8）以重構(gòu)修飾途徑，并通過(guò)優(yōu)化氧化還原電勢(shì)（Eh=-230 mV至-280 mV）改善二硫鍵形成效率。體外蛋白表達(dá)的這些修飾缺陷是目前制約其應(yīng)用于功能性糖蛋白生產(chǎn)的主要因素。大腸桿菌裂解物??是經(jīng)濟(jì)的體外蛋白表達(dá)平臺(tái)。his蛋白表達(dá)常見(jiàn)問(wèn)題

若需實(shí)現(xiàn)高階應(yīng)用（如非天然氨基酸插入、膜蛋白合成），無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)復(fù)雜度會(huì)明顯提升。例如，插入Azidohomoalanine需定制正交tRNA合成酶體系，且需優(yōu)化反應(yīng)中nnAA與天然氨基酸的比例；表達(dá)膜蛋白時(shí)則需添加脂質(zhì)體或納米盤以維持蛋白折疊。此類實(shí)驗(yàn)往往涉及多學(xué)科知識(shí)（合成生物學(xué)、生物化學(xué)），并依賴特殊設(shè)備（如微流控芯片工作站）。不過(guò)，隨著商業(yè)化試劑盒（如Thermo的PUREfrex2.0）和自動(dòng)化平臺(tái)（如ArborBio的AI優(yōu)化系統(tǒng)）的普及，部分操作正趨于標(biāo)準(zhǔn)化，降低了技術(shù)門檻。常用蛋白表達(dá)流程兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物??含??成熟血紅蛋白合成機(jī)制??，能準(zhǔn)確折疊多結(jié)構(gòu)域蛋白。

體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)的本質(zhì)是利用 純化的細(xì)胞裂解物（含核糖體、tRNA、翻譯因子及能量再生組分）重構(gòu)蛋白質(zhì)合成機(jī)器。在ATP/GTP供能條件下，核糖體通過(guò)mRNA模板介導(dǎo)的密碼子-反密碼子配對(duì)，驅(qū)動(dòng)氨基酸按序列聚合成肽鏈。該過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)包括：翻譯起始效率（受5'UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)及Shine-Dalgarno序列影響）、延伸速率（依賴EF-Tu/G因子濃度）和終止準(zhǔn)確性（釋放因子RF1/2活性）。體外蛋白表達(dá)的高效性源于其 去除了細(xì)胞膜屏障，使反應(yīng)底物濃度可人為提升至生理水平的10-100倍，大幅加速肽鏈合成動(dòng)力學(xué)。

無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)（CFPS）的雛形可追溯至20世紀(jì)50年代。1958年，Zamecnik頭次證明細(xì)胞裂解物中的翻譯機(jī)器可在體外合成蛋白質(zhì)，為技術(shù)奠定基礎(chǔ)。1961年，Nirenberg和Matthaei利用大腸桿菌裂解物破譯遺傳密碼子，推動(dòng)了分子生物學(xué)的發(fā)展。然而，早期技術(shù)因表達(dá)量低、穩(wěn)定性差，長(zhǎng)期局限于實(shí)驗(yàn)室研究，主要用于密碼子解析和翻譯機(jī)制探索，未實(shí)現(xiàn)規(guī)模化應(yīng)用。近十年，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)技術(shù)加速向醫(yī)療、合成生物學(xué)等領(lǐng)域滲透。例如，在COVID-19期間，該技術(shù)被用于快速生產(chǎn)疫苗抗原和抗體。同時(shí)，AI算法的引入實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)條件智能預(yù)測(cè)，進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)效率。中國(guó)企業(yè)如蘇州珀羅汀生物通過(guò)自主研發(fā)試劑盒，推動(dòng)國(guó)產(chǎn)化替代。未來(lái)，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)或與代謝工程、微流控技術(shù)結(jié)合，成為生物制造和準(zhǔn)確醫(yī)療的he xin工具。使用T7 RNA聚合酶合成加帽mRNA，可提升??真核體外蛋白表達(dá)??效率。

無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在快速響應(yīng)公共衛(wèi)生事件和jun shi應(yīng)用中表現(xiàn)突出。例如，在COVID-19期間，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)被用于數(shù)小時(shí)內(nèi)合成病毒抗原，加速疫苗候選物篩選。美國(guó)DARPA支持的“生物制造”項(xiàng)目利用凍干無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)試劑，在戰(zhàn)場(chǎng)環(huán)境中按需生產(chǎn)止血蛋白或抗體，實(shí)現(xiàn)便攜式、無(wú)需冷鏈的即時(shí)生物制造。這類場(chǎng)景凸顯了無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在時(shí)效性和環(huán)境適應(yīng)性上的不可替代性。根據(jù)應(yīng)用需求，無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)可整合非天然氨基酸（通過(guò)修飾tRNA）、脂質(zhì)體（用于膜蛋白表達(dá)）或翻譯后修飾酶（如糖基化酶）。芯片級(jí)體外蛋白表達(dá)??體現(xiàn)較前沿的進(jìn)展。大規(guī)模蛋白表達(dá)技術(shù)

添加0.5 mM鎂離子可優(yōu)化??小麥胚芽體外蛋白表達(dá)??的翻譯起始效率。his蛋白表達(dá)常見(jiàn)問(wèn)題

在無(wú)細(xì)胞合成生物學(xué)的框架下，可編程分子制造引擎的he xin角色可讓體外蛋白表達(dá)充當(dāng)。其模塊化特性允許研究者將生物系統(tǒng)解構(gòu)為三個(gè)可du li操作的層級(jí)：信息層：DNA/mRNA模板作為信息載體，其啟動(dòng)子強(qiáng)度（如T7系統(tǒng)表達(dá)量比SP6高3倍）與5'UTR二級(jí)結(jié)構(gòu)（ΔG<-50 kJ/mol時(shí)翻譯效率銳減）可自由優(yōu)化；執(zhí)行層：裂解物中的核糖體作為分子機(jī)器，通過(guò)補(bǔ)充非天然氨基酸（如對(duì)疊氮苯丙氨酸）擴(kuò)展產(chǎn)物化學(xué)空間；調(diào)控層：添加核糖核酸開(kāi)關(guān)（Riboswitch）或適配體（Aptamer）實(shí)現(xiàn)反饋控制，例如當(dāng)產(chǎn)物積累至閾值濃度時(shí)觸發(fā)終止子發(fā)卡結(jié)構(gòu)折疊終止反應(yīng)。這種分層控制使體外蛋白表達(dá)能夠驅(qū)動(dòng)人工設(shè)計(jì)基因回路的構(gòu)建，例如合成振蕩器系統(tǒng)中T7 RNA聚合酶的自抑制表達(dá)實(shí)現(xiàn)周期為120分鐘的蛋白質(zhì)濃度波動(dòng)，為構(gòu)建人工細(xì)胞提供可控的時(shí)空動(dòng)態(tài)基礎(chǔ)。his蛋白表達(dá)常見(jiàn)問(wèn)題