磷酸化蛋白的WB第三方檢測在實操過程中有哪些注意事項？研究完某一蛋白的磷酸化情況后比較好也要研究一下該蛋白總的表達量。如壓完 phospho-p38 抗體后，我會把相同的 membrane 做 strip 后再壓 p38, 然后再 strip 一次，再壓內標 actin 。做磷酸化蛋白 WB 時，除了目標蛋白的 band 以外，往往會出現非特異性的 band. 磷酸化抗體不好的話，甚至會壓出非特異性的 band, 而沒有你想要的 band, 所以壓片以后，一定要根據 markers 比對一下，壓出的 band 分子量是否正確。 磷酸化蛋白 WB 時 backgroud 也往往較深，所以壓片時間要適當，不能太長或過短，太長則 backgroud 太深蓋住想要的那條 band, 時間過短則可能沒有 band 或者 band 太淺。磷酸化蛋白 WB 時，要用TBST，不能用PBST。用 TBST 洗時也要注意一下，搖床的轉速不要太快，洗的時間不要太長，孵育一抗和二抗之后分別洗 5min 3 次即可，寧愿 background 深一些，總比做不出來強得多 . 另外，洗的時候，比較好不要把幾張 membrane 疊在一起洗。成都第三方檢測基礎實驗，找瑞普信。重慶人ELISA第三方檢測公司

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在做第三方檢測時為什么主帶之外有時會出現雜帶？導致雜帶出現的可能原因包括：抗體特異性不足，目的蛋白存在不同修飾狀態或有剪切降解形式，一抗或二抗使用過量，蛋白上樣量過大，曝光時間過長，膜漂洗不充分，等原因。通過條件優化盡量減少雜帶出現，但當抗體或樣品特性造成少量雜帶存在時，只要不影響主目的條帶判別并不影響數據圖片的應用。為什么有時膠片會出現明顯較深的背景？在通過條件優化排除諸如封閉不充分、樣品中存在雜質、抗體過量、漂洗不充分等實驗原因之外，當特異性識別的目的條帶信號太弱時，為了顯示出目的條帶而不得不延長曝光時間，隨之使得背景變臟，此時關鍵點在于整個反應的“性噪比”太低，比較好換用特異性、親和力更佳的一抗。瑞普信生物技術有限公司第三方檢測WB實驗。

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    3充分裂解后。12000rpm離心5min，取上清。4取部分上清蛋白用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按如下步驟①按試劑盒說明書將A液和B液以501的比例配制成工作液；②取2000μg/mL的BSA標準品，用PBSpH2000μg/mL、1500μg/mL、1000μg/mL、750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、25μg/mL、0μg/mL共9時間就是金錢，效率就是生命唯有惜時才能成功，唯有努力方可成就個濃度梯度；③取上清液10μL，用PBS稀釋20倍；④每管中加20μL蛋白標準品或稀釋后的上清液，再加上述工作液，37℃孵育30min，562nm處測吸光度，記錄OD值；⑤根據蛋白標準品的濃度及相應OD值繪制標準曲線標標準準曲曲線線yy00..00000077xx00..11553322RR2200..0..4400..8811..2211..000000濃濃度度uugg//mmLLOODD值值各各濃濃度度標標準準品品線線性性各各濃濃度度標標準準品品根據標準方程計算樣品總蛋白濃度（mg/mL）樣品.OD值mg/、Western-Blot檢測總蛋白中目的蛋白表達。1灌膠①蒸餾水清洗灌膠玻璃板，豎直晾干。②配制13％分離膠10mL，加TEMED10μL、10％過硫酸銨100μL，混勻后立即灌膠，灌至齒梳下緣2～3mm（事先做好標記），用異丙醇封閉液面以去除氣泡并隔絕空氣，室溫靜置45min待膠完全聚合。重慶人ELISA第三方檢測公司

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