而在指數增長期，由于底物充足，聚合酶活性高，反應產物以指數形式積累，且與初始模板量存在定量關系，因此，在該時期對模板起始量進行定量分析準確且重復性比較好。Ct值，是在指數增長期內，熒光信號到達熒光檢測閾值時所經歷的循環數，其中C循環(Cycle)，t閾值（threshold)。每條擴增曲線的Ct值都與初始模板量的對數存在線性關系，初始模板的拷貝數濃度越高，對應的Ct值越小;反之則越大。因此，先根據已知拷貝數濃度標準品的擴增曲線擬合出標準曲線方程，再將樣本擴增曲線的Ct值代入標準曲線方程中，便可計算未知樣本初始模板的拷貝數濃度，從而實現定量分析。qPCR熒光標記法分為SYBR Green I染料法為主的熒光染料嵌合法，以Taqman探針法為主的熒光探針法.廣州小巧qPCR儀消毒

PCR，qPCR，dPCR分別是什么?有什么區別?PCR，qPCR，dPCR分別是什么嗎?這些東西，在生物行業里見的比較多，我們生物行業的從業人員懂得應該多一些。PCR技術，在二十世紀八十年代被發明。現在DNA擴增已成為生物學研究的基礎。96孔板供應天津本生告訴大家，在過去的三十年中，這項經典技術已得到不斷改進，以解決研究中的新問題和新需求。從經典PCR，實時定量PCR到當前的數字PCR，PCR技術在不斷變化，但從未消失。如今，PCR技術已經從實驗室中分離出來，在遺傳鑒定和疾病診斷中發揮了巨大作用，并且在日益廣闊的領域中具有新的生命力。上海廠家qPCR儀使用說明Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統：快速 分秒必爭，43 分鐘完成40 循環qPCR 實驗。

合成引物時需注意：在設計PCR引物時，首先確定要擴增的DNA區域，并設計一對專門位于目標區域的引物，一個在正向鏈上，另一個在反向鏈上。引物須具有特異性，避免擴增出非特異性片段。正向引物與反向引物應具有相似的退火溫度，GC含量與退火溫度相關，調整引物長度可以改變退火溫度。避免引物序列有二級結構或引物二聚體，會降低PCR效率。許多的在線工具可用于輔助引物設計。PCR擴增包括三組被設定好的時間和溫度，步驟為：變性，退火和延伸1、變性：PCR的第一步稱為變性，將模板DNA加熱到95°C幾秒鐘，將兩條DNA鏈分開，使它們之間的氫鍵迅速斷裂。2、退火：反應混合物冷卻30秒至1分鐘。退火溫度通常為50-65°C，但確切的比較好溫度取決于引物的長度和順序。不同的引物可能具有不同的退火溫度。3、延伸：溫度升至混合物中存在的DNA聚合酶的理想工作溫度，通常約為72°C。DNA聚合酶附著在每個引物的一端，并合成與模板DNA互補的DNA新鏈。

交聯和裂解——穩定復合物并分離核組分:第一步對時間要求嚴格并且需要優化。體內共價交聯穩定蛋白質-DNA相互作用并于特定時間點進行分析。通常采用甲醛交聯，加入甘氨酸以終止反應。交聯劑滲透到完整細胞中并將蛋白質-DNA復合物鎖定在一起從而進行分析。交聯劑在整個過程中保持復合物穩定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩定的蛋白質-DNA相互作用則不需要交聯。接下來，使用裂解液透化細胞膜，釋放細胞組分，然后蛋白質-DNA復合物變得可溶。去除細胞溶質蛋白以減少背景信號并增加靈敏度。注意：此時可以停止ChIP測定。 經過交聯，淬滅和洗滌細胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲存。qPCR 反應所需時間取決于反應溶液進行變溫所需要的時間，這過程受到加熱塊升降溫速度和液體升降溫速度影響。

制備DNA——解交聯和DNA純化現在含有目標蛋白質的染色質片段已分離，需要解交聯并純化DNA。解交聯通常采用高熱孵育和/或消化來完成。注意：此時可以停止ChIP。經過解交聯和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲存。定量DNA——測定目標蛋白質-DNA水平在該步驟中，通過qPCR定量純化的DNA產物，通過qPCR，您可以確定目標蛋白是否存在于特定位點。ChIP的qPCR如何定量分析ChIP-qPCR 數據需要針對可變性來源進行標準化，包括染色質數量、免疫沉淀的效率（富集效率）和 DNA 回收率。兩種常用的標準化 ChIP-qPCR 數據方法——Percent Input法和富集倍數法（Fold Enrichmen）。與input相關的ChIP-qPCR數據包括ChIP的背景水平和input染色質的標準化。建議ChIP 實驗重復，盡可能將結果與背景信號和標準誤差一起顯示。為了進一步確保熒光檢測的就是靶DNA序列，人們又設計了只能與目的DNA序列特異結合的熒光探針如TaqMan探針。佛山單通道qPCR儀使用說明

準確的溫度控制與快速的變溫系統是實現高效的 qPCR 實驗的基礎與關鍵。廣州小巧qPCR儀消毒

免疫沉淀——捕獲并分離蛋白質-DNA復合物使用抗體捕獲蛋白質-DNA復合物中的目標蛋白質是實驗成功的關鍵因素。抗體免疫沉淀并從細胞核組分中分離蛋白質，去除不相關的細胞物質。使用抗體結合磁珠完成所得抗體-蛋白質-DNA復合物的純化。經過孵育后，充分洗滌磁珠-抗體-蛋白質-DNA復合物，純化并洗脫蛋白質-DNA復合物。制備DNA——解交聯和DNA純化:現在含有目標蛋白質的染色質片段已分離，需要解交聯并純化DNA。解交聯通常采用高熱孵育和/或消化來完成。注意：此時可以停止ChIP。經過解交聯和/或DNA純化后，可以將樣品于-20°C儲存。廣州小巧qPCR儀消毒

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