dPCR的測量結果通常表示為含量,即拷貝數值或轉基因質量百分比,而QPCR結果通常表示為拷貝數的質量分數。目前市場上可購買到大多數轉基因標準物質,以qPCR定值的標準物質是以拷貝數(單倍體基因組當量)的質量分數來表示特性量;以dPCR定值的標準物質直接采用拷貝數比例來表示特性量。不同方法使用不同的表示方式,會造成測量結果不可比。因此質量分數、拷貝數和拷貝數比例之間的關系需要轉化,才能得到單位一致,數值可比的數據。EU聯合研究中心建議使用轉換因子從拷貝數換算到質量分數。影響dPCR定量結果的因素:儀器采用的分散方式與數量、溶液稀釋方法、分散體積的準確性以及結果表達方式。華南地區全自動多重數字PCR性能特點
現有dPCR分析方法采用熒光探針和基于光的檢測方法來鑒定擴增產物。這些方法要求足夠的靶分子擴增以產生足以被檢測到的信號,但可能會導致額外的錯誤或偏差,因此,希望能夠提供一種改進的、用于檢測樣品內感興趣的核酸的方法,其采用替代性分析方法,具有提高的準確度和精確度,并且其具有可以與基于dPCR的方法關聯使用的靈敏度。dPCR還在樣品內進行單一反應,但是所述樣品被分離成大量的分區(partition),并且所述反應在每個分區中單獨進行。這種分離允許對核酸量進行靈敏的測量。DPCR已被證明可有效用于研究基因序列中的變異,例如拷貝數變異或點突變。蘇州微滴式數字PCR解決方案經過PCR循環之后,有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號,沒有模板的反應器就沒有熒光信號。
PCR(PolymeraseChainReaction)技術,即聚合酶連反應,是一種擴大和復制目的片段DNA的技術,其發現對于生命科學的發展具有重要的意義。而3D數字PCR到底是什么鬼?它其實是出現的一款PCR儀,其具有對目的DNA分子做出定量的優點,進而提供的準確性、靈敏度。應用該技術,實現對DNA進行精確定量,精確度可通過復制次數實現。通過準確性的進行定量檢測基因,有助于臨床上在、病毒等疾病作參考。同時,其具有高通量,檢測速度快,成本相對低等優點,為后期精細奠定基礎。
PCR常使用目標序列的拷貝數或某一給定樣品中轉基因的百分比來體現方法靈敏度。由于qPCR和dPCR實驗過程所用試劑的兼容性較好,在使用dPCR進行轉基因檢測時,通常直接參照qPCR的方法。使用不同技術對相同樣品檢測時,兩種方法的靈敏度是否具有可比性成為關注的問題。Burns等21]使用Fluidigm公司的12.765(12板,每板765個微單元)芯片數字PCR分析儀測定標準物質ERM-AD413檢測轉基因玉米MON810。該小組應用dPCR技術評估在qPCR定義下的靈敏度數值,在拷貝數200-700之間,dPCR與qPCR的測量結果具有一致性。但與qPCR的靈敏度相比,dPCR在低于拷貝數200時有被低估的風險,在高于拷貝數1000時有被高估的風險。dPCR在同一陣列上同時測量轉基因和內源性靶點時,需要稀釋內源性靶點和轉基因靶點在合理拷貝數范圍內以保證dPCR測量結果的準確性。通過“儀器+試劑”相互配合的方式,打出了數字PCR檢測的“組合拳”。
微滴數字PCR主要是將兩種互不相溶的液體,以其中一種作為連續相(油),另一種作為分散相(水),在水/油兩相表面張力和剪切共同作用下分散相以微小體積單元的形式存在于連續中,從而成液滴。這種液滴式的反應腔室具有體積小、樣品間無擴散等優勢。在ddPCR中,利用微滴發生器可以一次生成數萬乃至百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴,作為數字PCR的樣品分散載體。這里,液滴中包裹了單拷貝DNA模板和PCR反應液,然后將液滴收集在PCR反應管中進行擴增。?PCR反應結束后檢測每個微滴的熒光信號。目前Bio-Rad公司的QX100系統、QX200系統均為采用液滴技術的數字PCR系統。圖6.Bio-Rad的液滴數字PCR系統dPCR被稱作第三代PCR技術,但dPCR技術的廣泛應用逐漸顯現出一些不足之處。華南地區賽默飛數字PCR系統
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dPCR的結果統計方式有2種,一種是采用標記多種顏色,通過不同檢測通道分辨不同顏色和強度,再根據分散液滴的數量計算待測基因的含量;另一種采用概率統計的數據處理方法,即通過泊松分布的方法對結果進行分析。應用概率統計分析數據和對數據處理方法的模型直接關系著結果的準確性和分析時間的長短。常用的統計方法是假設每個微反應單元的體積相同,根據泊松統計計算拷貝數,公式為:M=-Vx1n(1-x/)其中M是目標總拷貝數量;V是微反應單元數量;x是發光的微反應單元數量。華南地區全自動多重數字PCR性能特點
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