在熒光定量PCR應用已經如此的情況下，緣何數字PCR仍然能橫空出世？中心點在于熒光定量PCR盡管為科研和臨床市場應用提供了非常重要的檢測工具支撐，但仍然有尚未被滿足的客戶需求。熒光定量PCR需要基于標準品制作的標準曲線進行定量，屬于相對定量，操作較為復雜，且終端用戶對其結果的重復性、靈敏性、精密度、分辨率、對PCR反應抑制劑的耐受性等方面有更高的期待。數字PCR通過將反應體系進行有限稀釋至成千上萬的反應單元中，實現了核酸靶標的單分子擴增。PCR擴增結束后，基于終點法對陽性液滴數和總液滴數進行計數，結合泊松分布原理，從而實現對起始樣本的定量。其極大地簡化了操作步驟，并且大幅提高了檢測性能，尤其在低豐度或較低豐度的核酸檢測上（靈敏性可達0.001-0.0001%），其優異的性能得到了終端用戶的認可。Drop-off數字PCR檢測方法的**主要優勢是能夠能夠在一個反應中檢測到基因組序列范圍短的同源基因突變。廣東臻準數字PCR解決方案

產物越短，往往擴增效率越高。模板二級結構（Templatesecondarystructure）：PCR變性中和變性后的單鏈DNA不夠穩定，容易自發折疊形成二級結構。應避免可形成穩定二級結構的模板鏈區域，因為如果模板鏈形成的二級結構在退火溫度下穩定存在，定位在模板鏈二級結構處的引物將無法同模板鏈相結合。使用mfold可預測引物待結合的區域是否存在復雜的二級結構。設計引物時，盡量使引物定位在模板二級結構以外的序列上。避免具有4個以上相同的連續堿基的區域（Avoid>4repeatsofsamebases）：以避免延伸階段聚合酶“滑動（PolymeraseSlippage）”。選擇GC含量（GCContent）在50-60%之間的區域。如果高GC含量區域不可避免，可以嘗試提高退火溫度，并使用添加劑，例如甘油，華南地區一體化數字PCR油滴制造目前dPCR中體積優化方法以光學顯微鏡觀測為主。

數字PCR產品的發展，為不同場景下的多樣化核酸檢測需求提供了新的思路，尤其是在醫學檢驗方面，在 性疾病早期檢測、病癥的液體活檢、無創產前檢查等領域展現出良好的應用前景。實現 性疾病早期高效檢測——以病毒為例，有病毒檢測、和臨床樣本病毒載量評估He監測環境病毒載量；二代熒光定量PCR檢測技術是目前病毒檢測的"金標準"，但由于病毒探針結合位點突變、樣本病毒載量不足等原因，在臨床檢測過程中經常出現假陰性結果，由于數字PCR具有更高的靈敏度、精細度，以及其適合痕量樣本檢測的特性，能夠檢測出熒光定量PCR檢測過程中錯過的 ，可作為后者的補充。在人群篩查及臨床診療中，為科學選取采樣方式，需要評估不同臨床樣本病毒載量，如鼻咽拭子、血尿、糞便、肺泡灌洗液等，由于數字PCR可提供一定程度上量化指標，為采樣方法的選取提供了參考，從而提高檢出率。在外防輸入的戰略要求下，環境病毒檢測工作尤為重要，數字PCR可對低核酸豐度樣本進行有效檢測，包括從不同環境中取樣的樣本，如病房、醫院衛生間、實驗室等等，在病情防控中起到了不可忽視的作用。此外，數字PCR的應用場景還有病程不同階段的病毒載量評估、核酸參考品制備、抗病毒藥物研發等環節。

數字PCR是一種核酸分子定量技術。當前核酸分子的定量有三種方法，光度法基于核酸分子的吸光度來定量；實時熒光定量PCR（RealTimePCR）基于Ct值，Ct值就是指可以檢測到熒光值對應的循環數；數字PCR是的定量技術，基于單分子PCR方法來進行計數的核酸定量，是一種定量的方法。主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少于或者等于1個。這樣經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。相較于qPCR，數字PCR可讓你能夠直接數出DNA分子的個數，是對起始樣品的定量。

盡管我國dPCR行業起步較晚，但在國家鼓勵醫療器械創新的大背景下，以及精細醫療和個性化用藥等需求推動下，dPCR成為了近年廣受關注的熱點領域，保持著穩定快速的增長。近年來國內誕生了如領航基因、新羿生物、銳訊生物、科維思、永諾生物、泛生子、思納福醫療等企業，開始與國外企業同臺競技。從市場角度看，北美依然是dPCR比較大的主導市場，其次是亞洲和歐洲。由于性疾病和的高發病率以及患者對這些疾病的早期診斷意識的提高，亞太地區將成為dPCR增長速度快的市場。伯樂、凱杰、賽默飛、羅氏、因美納等公司紛紛通過收購、投資等方式布局dPCR業務。數字PCR的兩大應用場景在于基因檢測、無創出生缺陷篩查。法國全自動數字PCR儀器

經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。廣東臻準數字PCR解決方案

Drop-off實驗包括兩個針對相同擴增子的TaqMan探針：與野生型序列互補而與突變位點不發生互補的Drop-off探針和與突變型和野生型基因都互補的Reference探針（如圖1A）。在野生型等位基因的存在下，Drop-off探針和Reference探針都將與目標雜交，產生雙重陽性信號（如圖1B，藍色群）。相反，如果存在突變的等位基因，即使一個核苷酸的突變也會阻止Drop-off探針與之雜交，因此只有Reference探針對目標基因進行退火，從而得到一個陽性信號。廣東臻準數字PCR解決方案

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